沉降菌和浮游菌监测作为日常生产过程中微生物

公司新闻     |      2019-01-11 17:43
沉降菌和浮游菌监测作为日常生产过程中微生物监测的两种方式
沉降菌监测                                                       
浮游菌监测

沉降菌和浮游菌监测作为日常生产过程中微生物监测的两种方式,一直在被大家广泛使用。Chris在过去十多年中,也不断被大家提问到 “到底应该用浮游菌还是沉降菌监测?”在新年伊始,我们来一起看看这两种采样方式的是是非非。

 

 
 
 

法规要求

 
 

 

GMP对于制药行业内测试方法需要参照ISO的测试方法,而ISO 14698-1微生物污染控制法规提到微生物监测需要评估收集效率(Collection efficiency ),高的收集效率的采样方法和采样设备可以得到更有代表性的数据。对于生物负载环境低的环境,如A、B级环境,应当更多的采用主动采样的浮游菌采样,而不是被动采样的沉降菌方法。

 

ISO 14698-1 附录中对于微生物采样器的收集效率提出了进行收集效率评估的指导意见。现行的2003版的ISO14698对于收集效率分为物理收集效率和生物收集效率,其中物理收集效率更在意的是采样方法是否有能力收集到空气的携菌粒子,而生物收集效率更在意的是采样器或者采样方法是否能在收集到的同时保证该携菌粒子的存活率。 
 

厂家有义务和有责任提供基于以上两种收集效率的验证文件。如果厂家无法提供,制药企业需要开发相关的方法验证证明其使用方法的收集效率。我们通常认为以上两种收集效率要达到一定的灵敏度以上方可使用(具体灵敏度要求以及验证方法可向PMS咨询)。

 

 
 
 

沉降菌的采样效率

 
 

 

解决了上述微生物采样器的采样效率验证,我们又回到了沉降菌的采样效率评估,这是行业内的痛点,因为我们都知道沉降菌的采样方法属于被动采样方式,回收率相当低,无法进行方法验证。

 

 “Active Air vs. Passive Air (Settle Plate) Monitoring in Routine Environmental Monitoring Programs” (日常环境监测计划中的主动空气与被动空气沉降菌监测的比较)(Reference 1).

——科学家Barbara M. Andon

美国注射剂行业协会(PDA)杂志

文章中对于沉降菌在无菌制药生产日常监测的收集效率进行评价后发现:基于地心引力的被动采样方式,能够得到12微米粒径的活性粒子沉降到9cm的采样平皿上的收集效率为0.106 CFU/h,沉降到14cm的采样平皿上的收集效率为0.256CFU/h。而对于1微米粒径的活性粒子沉降到9cm 的采样平皿上的收集效率为0.008 CFU/h 。如果A级区最大浓度限度为1CFU/m3, 那么一个9cm 平皿需要暴露于A级区采样1250小时(相当于52天),才能在低生物污染负载环境检测到一个有意义的数据(一个CFU)。

 

所以文中科学家得到结论:沉降菌“是一种太不灵敏的采样方法”,以及“沉降菌更好的反映了携菌粒子的沉积效果,仅在较大平皿采样(如14cm)或者多个采样平皿采集时灵敏些”。文中科学家发现对于主动采样方法采集1微米的粒子的收集效率比9cm的被动采集的沉降菌方法的效率高2250倍。对于A级区层流环境的微生物采样,建议采用更加灵敏的采样方法。

 

Chris认为沉降菌等采样方法对于相对微生物负载量较高的非无菌工艺的C,D级环境,可以作为一个微生物采样的补充,配合浮游菌采样方法可以一起使用。对于A,B级环境,浮游菌采样方法作为更高效的采样方法更适合。

 

 
 
 

日常监测中的风险

 
 

 

如大家所知,欧盟GMP无菌生产的附录一的草案于2017年12月24日发布,其中非常大的变化在于:

a) 微生物及相关的提法增加了2倍(原附录提到23次,新草案提到68次)

b) 对于风险的提法增加了将近4倍(原附录提到20此,新草案提到92次)。

 

我们因此可以了解监管部门对于微生物和风险的要求重视程度达到前所未有的高度。其中对于日常监测中,新附录9.7条提到A级区的活性粒子(微生物)监测位置应该是无菌生产污染风险最高的位置,如无菌表面,开口的容器胶塞等。而在9.29条提到,活性粒子(微生物)的采样方法不应当对于制药生产带来任何污染的风险(Reference 2)。因此,我们可以看到监管部门的想法,他既认为微生物监测非常重要,又认为采用不恰当的采样方法会对生产环境带来负面影响。

 

这是我们行业的一个两难。之前很多企业由于无法找到一个合适的微生物方法,担心浮游菌采样方法的平皿频繁更换会对制药环境带来污染,因此决定不进行主动微生物(浮游菌)监测。随着现代制药工业发展,我们已经认识到了需要提升我们对于微生物采样方法的风险评估和风险识别。

 

 

 

沉降菌方法可能会对于环境造成污染,我们知道沉降菌表面有大量的营养水分,在10微米至20微米之间,当沉降菌暴露在关键生产的A级环境中,这些营养水分很可能会被吹到无菌表面,药瓶容器内,药液当中,造成污染和交叉污



浮游菌采样由于培养基比较容易干燥,现代的采样流速设计为低流速采样,可以尽量的延长浮游菌采样的覆盖生产的时间,不要频繁进行平皿更换。通常会考虑到A级层流环境的气流保护的目的,我们对浮游菌采样也要进行等动力采样设计,确保采样器上方的空气呈现等速采样,不会对现场造成污染。PMS对于等动力采样的设计为25升/分钟,如使用市场上通用的9cm平皿,可持续40分钟连续采样;如采用PMS专利的一次性采样平皿的技术,可持续2小时连续采样。采用以上方法,可以最大化的减少对于A级环境更换平皿的干预动作

 

 

 



传统的微生物采样方法为把整个采样器放入A级环境,而现代的无菌工艺控制方法要求任何进入A级的材料设备都要进行充分的灭菌。传统方法把采样器放入A级,由于采样器内部的线路板电气部件无法进行彻底的灭菌,通常企业采样VHP或者酒精消毒采样器表面,无法到达彻底的灭菌的效果。WHO无菌工艺控制要求中建议制药企业应当采样分体式的微生物采样方法,即把采样头和采样器进行分离,采样头放入A级并可提前进行高温或者化学灭菌,而采样器放在B级背景环境进行操作。这样的话,可以规避采样器无法彻底灭菌对于A级区的影响。

今年来监管部门发布了众多“数据完整性和合规”的法规,我们在微生物监测的过程中需要把计划采样的设置,实际采样的情况都以满足数据完整性的系统来进行记录,比如什么时候开始,什么时候结束,实际采样流速多少,计划采样流量或者时间多长,实际流量或者时间多少,什么人操作的,有没有流速报警或者预警等等。现在的浮游菌采样器的内置软件可设置三级权限,可对所有的采样过程进行监控,并生成不可更改的监测记录,方便进行追踪。而沉降菌的采样更依赖于纸质记录管理,流转中的管理风险较大。

 

 

 
 
 

结论

 
 

 

综上而述,经过效率验证的浮游菌采样方法对比沉降菌采样方法的收集效率更为高效,适合用于关键的,生物负载低的无菌生产环境。而沉降菌采样方法可作为一种生产过程中浮游菌采样的补充方法,可用于相对不关键,生物负载高的非无菌环境,使用时需要避免放置位置不当或者操作错误而造成的污染风险。无论采用何种方法,都应当基于生产工艺的风险评估来确定位置,采样频率,采样覆盖时间以及采样流速等。

 

沉降菌和浮游菌作为制药生产过程中的监测方法,我们应当基于风险评估来选择和考虑采用哪一种方法。现代的无菌制药控制对于关键区微生物采样更倾向于主动采样方式(浮游菌),而不是低灵敏度的被动采样方法(沉降菌),需要重视采样方法对于生产环境的影响,提高无菌工艺控制水平和基于风险评估的科学方法。